Bakterie a bakteriofág

Lidé mají bakterie zafixované především jako původce lidských chorob. Málokoho proto napadne, že i bakterie mohou onemocnět. Nejběžnějším patogenem bakterií jsou viry specializované na proniknutí do těchto obrněných buněk – bakteriofágy. Bakteriofágy (zkráceně také fágy) jsou až na výjimky dvouvláknové DNA (dsDNA) viry, přičemž při přisednutí bakteriofága na povrch buňky se dovnitř bakterie dostává pouze virová DNA a zbytek virionu zůstane na povrchu.

U tak zvaných temperovaných fágů se virová DNA zabuduje do chromozomu hostitelské buňky (této DNA se říká profág). Pak se spolu s chromozomem dědí, takže se nalézá ve všech dceřiných buňkách vzniklých z původní napadené buňky. Druhá sorta virů se jmenuje virulentní fágy. V jejich případě se podle virové DNA začnou v cytoplazmě hostitelské buňky viry ihned množit. Ve chvíli, kdy je buňka plná zralých virů lyzuje (praskne) a uvolněné viry mohou napadnout další buňky (do větší hloubky se o bakteriofázích můžete dočíst v oddíle „Viry“). Temperovaný fág se za jistých okolností začne chovat jako virulentní fág a svou hostitelskou buňku tak zničí.

Pro bakterie je životně důležité vlastnit nějaký mechanizmus, který by je před virovým napadením ochránil. Dva nejběžnější systémy protivirové ochrany jsou: restrikčně modifikační systém a CRISPR Cas systém.

Restrikčně modifikační systém (RM systém)

RM systém je založen na enzymech zvaných restrikční endonukleázy a metylázy. Restrikční endonukleázy dokážou přestřihnout DNA ve velmi specifickém místě. Každá restrikční endonukleáza má cílové místo odlišné,   nicméně všechna tato místa jsou palindromy. Palindromem se v češtině označuje věta, která se z obou stran čte stejně (Jelenovi pivo nelej.). V molekulární biologii vypadá palindrom trochu odlišně. Palindromatická je například následující sekvence: ATCGTACGAT. Na první pohled to jako palindrom nevypadá. Dopište si však komplementární vlákno a zjistíte, že toto vlákno se z druhé strany již čte stejně. Palindromatické sekvence jsou tedy cílová místa restrikčních endonukleáz. Objeví-li se v buňce virová DNA s touto sekvencí, je ihned rozštěpena a dále degradována na jednotlivé nukleotidy.

Restrikční endonukleázy však nedokáží odlišit virovou a bakteriální DNA. Stačí jim, když najdou cílové místo a to rozštěpí. Problém však je, že se v bakteriálním chromozomu takovýchto sekvencí vyskytuje větší množství. Buňka si tato místa musí ochránit a v tom jí pomáhají metylázy modifikačního systému, které modifikují cílové místo endonukleáz navázáním metylové skupiny na cytozin. Takto metylovaný palindrom je restrikční endonukleázou ignorován. To znamená, že jediná DNA s nechráněnými palindromy může být pouze cizorodá DNA, které je dobré se zbavit.

Viry se však proti restrikčním endonukleázám dokážou postavit. Vzhledem k mutační rychlosti virů dříve nebo později dojde k záměně nukleotidu (mutaci) v palindromatické sekvenci. Palindrom přestane být palindromem, endonukleáza už toto místo nerozpozná a bakteriofág může být spokojen. Zvítězil.

CRISPR Cas systém

Bakterie však mohou vlastnit ještě další systém na boj s bakteriofágy. Jmenuje se CRISPR Cas systém a za jeho využití v laboratoři dostaly v roce 2020 Nobelovu cenu Jennifer Doudna (*1964) a Emannuelle Charpentier (*1968). RM systém je někdy přirovnáván k vrozené (nespecifické) imunitě obratlovců a CRISPR Cas systém k imunitě adaptivní (specifické).

CRISPR Cas systém je o něco komplikovanější než RM systém. Dokonce se mezi různými bakteriemi dají najít tři odlišné CRISPR systémy. Označují se Typ I, II a III. Tyto typy se liší v různých detailech, přičemž nejznámější je nepochybně typ II, protože za výzkum právě tohoto systému byla udělena Nobelova cena. My se však blíže podíváme na Typ I. 

Celý proces bakteriální odpovědi na virovou nákazu je docela komplikovaný a dělí se na tři časově i prostorově oddělené děje. Rozeznáváme CRISPR adaptaci, biogenezi a interferenci.

Aby se bakterie dokázala virům ubránit, potřebuje je nejprve rozpoznat. K tomu slouží CRISPR adaptace.  Jedná se o proces vytváření DNA databáze krátkých virových úseků v bakteriálním chromozomu. Právě tato databáze dostala jméno CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). Struktura CRISPRu je velmi zajímavá. Je totiž poskládán z krátkých virových DNA úseků – spacerů – oddělených palindromatickými repeticemi. Součástí adaptace je přidávání nových spacerů do CRISPRu. Je-li bakterie napadena novým virem, dokážou enzymy Cas 1 a 2 tuto DNA rozpoznat jako DNA škodlivou, přičemž z virové DNA vystřihnou krátký úsek a vloží ho do CRISPRu jako další spacer. Od této chvíle si bakterie virus „pamatuje“. Samozřejmě, že si ho od této chvíle pamatují i všechny její dceřiné bakterie. Každá bakterie tuto databázi zdědí po svých předchůdkyních a v případě, že bude mít štěstí, a přežije další napadení virem, přidá jednu novou položku do databáze (další spacer do CRISPRu). 

Je-li bakterie napadena bakteriofágem, spustí se další část odpovědi – biogeneze. CRISPR je přepsán do dlouhé RNA označované pre-crRNA. Palindromy, které se samozřejmě také přepsaly, vytvoří na RNA vlásenkové struktury. Pre-crRNA je dále enzymaticky naštěpena na krátké úseky (spacer s vlásenkou), jež už jsou označovány jako crRNA. Tyto crRNA na sebe naváže další Cas enzym. My se podíváme, jak to vypadá v případě komplexu enzymů Cascade Cas3, které jsou součástí Typu I. 

Nyní přijde na řadu finální fáze nazývaná interference. Pro komplex enzymů označovaný Cascade je crRNA naváděcí molekulou. Ze všech Cascade s navázanými crRNA nyní budeme sledovat jeden konkrétní komplex, který má navázanou správnou crRNA. Bakterii totiž napadl virus, jehož DNA se již nachází v CRISPRu jako jeden ze spacerů, a právě tento konkrétní spacer dal vzniknout naší crRNA. Cascade se naváže na virovou DNA a klouže po ní až do místa, které je komplementární k naváděcí crRNA. Tato kopmplementární RNA tak zvaně interferuje s virovou DNA. Na tomto místě se komplex zastaví a připojí se k němu enzym Cas3, který molekulu DNA přestřihne. Tím pádem byl virus zničen.

Obě výše uvedené vědkyně si uvědomily potenciál CRISPR Cas systému. Daly dohromady molekulárně biologickou techniku editace DNA založenou CRISPRu odpovědi Typu II, který je o něco jednodušší než popsaný Typ I. Součástí CRISPRu odpovědi Typu II je enzym Cas9. Tento enzym dokáže přestřihnout obě vlákna DNA. S enzymem Cas9 může být svázána RNA sestavená v laboratoři a tento enzym může být naveden na jakékoli místo DNA v jakékoli buňce. Jeden čínský vědec tuto techniku dokonce v roce 2018 použil na opracování lidských embryí, ze kterých se narodily dvě děti. Za své neetické chování a za pokusy na lidech byl nejen exkomunikován vědeckým světem, ale dokonce putoval do vězení.

Závody ve zbrojení

V poslední době se ukazuje, že podobných „imunitních“ systémů mají bakterie v zásobě větší množství. Jejich udržování je však pro buňku velmi náročné, a proto se v jedné bakterii zpravidla potkáme s jediným „imunitním“ mechanizmem. Bakterie si však dokážou nějaký systém pořídit pomocí horizontálního přenosu mezi různými bakteriálními kmeny.

Viry díky vysoké mutační rychlosti vždy vytvoří nějaký klon, který danou obranu bakterie překoná. Ta si pak musí pořídit nový obranný systém a situace se za chvíli začne opakovat. Viry i bakterie se navzájem udržují v patové situaci závodů ve zbrojení. Na každou akci se dříve či později objeví protiakce. Tomuto stavu se říká koevoluční „závody ve zbrojení“ (nebo také efekt červené královny).

Na tomto místě by bylo dobré nepředstavovat si jednu konkrétní bakterii a jeden konkrétní virus. Sledovat musíme vždy celé populace. V populaci může být i jedna jediná bakterie rezistentní proti dané virové nákaze, přičemž potomci této bakterie postupně v populaci převládnou a nahradí všechny bakterie, které jsou k virové nákaze vnímavé. Z odstupu obřího eukaryotického organizmu (jakým člověk je) je však tento boj takřka neviditelný a zdánlivě se nic neděje.

Shrnutí

Nejběžnějším bakteriálním patogenem jsou pravděpodobně bakteriofágy. Ty mohou bakteriální populaci úplně zničit a z toho důvodu si bakterie vyvinuly různé systémy ochrany. Jedná se především o restrikčně modifikační (RM) systém a CRISPR Cas systém. Oba tyto systémy dokáží odlišit vlastní DNA od cizorodé a následně tuto cizorodou DNA zneškodní. Trochu překvapivě stačí DNA přestřihnout pomocí endonukleáz a tím je DNA inaktivována. Bakteriofágy se však díky mutacím dokáží bránit a bakterie musí obranné systémy střídat.